Spektrometria mas (MS, Mass Spectrometry) – uniwersalna technika analityczna, zaliczana do metod spektroskopowych, której podstawą jest pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego danego jonu.
Pierwszy spektrometr mas został zbudowany przez J. J. Thompsona w 1911 roku. Współcześnie istnieje wiele odmian tej techniki, z których każda posiada inne zastosowanie i wymaga stosowania aparatów o innej konstrukcji. Wszystkie te techniki są jednak oparte na jonizacji cząsteczek lub atomów, a następnie detekcji liczby jonów w funkcji ich stosunku masy do ładunku (m/z). Wyniki działania spektrometru mas są przedstawiane w postaci tzw. widma masowego.
Spektrometria mas służy do:
  • identyfikacji związków chemicznych i ich mieszanin,
  • ustalania struktury związków chemicznych,
  • ustalania ich składu pierwiastkowego,
  • ustalania składu izotopowego analizowanych substancji, co m.in. umożliwia określenie ich źródła pochodzenia
  • precyzyjnego ustalania składu złożonych mieszanin związków o wysokich masach molowych w proteomice, badaniach materiałowych i chemii polimerów.
Niezależnie od konstrukcji i przeznaczenia, we wszystkich spektrometrach mas występują następujące elementy:
  • źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji,
  • analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku.
  • detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.

Budowa i działanie spektrometru mas

Działanie tradycyjnego spektrometru mas opiera się na odchylaniu strumienia jonów badanej substancji w polu elektrycznym. Wszystkie cząsteczki analizowane w spektrometrze mas muszą mieć ładunek elektryczny. Wewnątrz spektrometru mas panuje próżnia, dzięki czemu ruch jonów nie jest zakłócany przez zderzenia z cząsteczkami gazów.
Pierwszym przedziałem spektrometru mas jest źródło jonów. Urządzenie to przeprowadza substancje analizowane w spektrometrze w jony unoszące się w fazie gazowej. Zjonizowane cząsteczki przechodzą do dalszych przedziałów spektrometru mas, gdzie formowana jest wiązka jonów. Wiązka ta jest kierowana do analizatora masy.
Analizator masy rozdziela jony ze względu na stosunek ich masy do ładunku. Jony kierowane są do detektora, który zamienia w sposób ilościowy sygnał w postaci prądu jonowego na sygnał elektryczny, który jest rejestrowany przez komputer w postaci widma stosunku masy do ładunku elektrycznego (nazywanego często widmem masowym). W widmie takim na osi poziomej odłożone są stosunki mas do ładunków w thompsonach (1 Th = 1 dalton / liczba ładunków elementarnych jonu), na osi pionowej intensywności (liczba jonów zarejestrowanych przez spektrometr).
Spektrometria mas -
z jonizacją typu electrospray i dwoma analizatorami – kwadrupol i TOF). Oś pozioma:stosunek masy (m) do ładunku (z) jonu. Oś pionowa: liczba zliczeń danego jonu przez detektor

Określanie masy cząsteczek

Ze stosunku masy do ładunku jonu można zwykle wywnioskować, jaka była masa cząsteczkowa analizowanego związku chemicznego lub jego fragmentu. Metody jonizacji w niektórych spektrometrach mas są tak dobrane, aby ładunek (z) był dla większości jonów równy 1, a zatem przy interpretacji widma można przyjąć, że m/z odpowiada po prostu masie cząsteczkowej jonu. Warto zauważyć, że masa cząsteczkowa jednokrotnie naładowanego jonu jest w przybliżeniu równa masie cząsteczkowej niezjonizowanej substancji tylko wtedy, gdy jonizacja jest dokonywana przez dołączenie elektronu (ze względu na bardzo małą masę elektronu). Jeśli do cząsteczki dołączany jest proton, to masa jonu jest większa od masy substancji niezjonizowanej o masę protonu (1,00727646688 Da).
Dokładną masę badanego, wyjściowego związku chemicznego, na podstawie miejsca występowania sygnału powstałego z jego niepofragmentowanego jonu w widmie można obliczyć według wzoru:
\[m_{zw} = (m/z) * z - m_{cz} \]
gdzie 
  mzw – masa wyjściowej cząsteczki, która ulegała jonizacji bez fragmentacji
  m/z – wartość odczytana z dobrze skalibrowanego widma dla niepofragmentowanego jonu, odpowiadająca stosunkowi masy analizowanej cząsteczki w daltonach do liczby ładunków elementarnych (z) które niósł z sobą jon, który wygenerował analizowany sygnał;
  mcz – suma mas cząstek lub jonów, które nadały ładunek poprzez przyłączenie się do wyjściowej cząsteczki w daltonach, (protonu – 1,00727646688 Da; elektronu około 0,00054862 Da). Jeśli jonizacja następuje na skutek oderwania cząstki to należy podstawić jej masę ze znakiem minus.

Jeżeli cząstką dołączaną lub odrywaną jest elektron, jego masę można pominąć (uproszczony wzór: \[m = (m/z) * z \]).
Przykładowo na przedstawionym wyżej diagramie pik odpowiadający m/z = 435,776 Th może pochodzić od:
  • jonu posiadającego jeden ładunek elementarny powstałego przez oderwanie elektronu z cząsteczki o masie 435,776 Da (masa elektronu jest pomijalnie mała)
  • jonu posiadającego jeden ładunek elementarny powstały przez przyłączenie jednego protonu, który powstał z cząsteczki o masie 435,776 − 1,007 = 434,769
  • jonu posiadającego dwa ładunki elementarne, który powstał przez oderwanie dwóch elektronów z cząsteczki o masie 435,776 * 2 = 871,552 Da (ponownie masę elektronów można zignorować)
  • jonu posiadającego dwa ładunki elementarne na skutek oderwania jednego elektronu i przyłączenia jednego protonu, pochodzącego z cząsteczki o masie 435,776 * 2 − 1,007 = 870,545 Da
  • jonu posiadającego dwa ładunki elementarne na skutek przyłączenia dwóch protonów, pochodzącego od cząsteczki o masie 435,776 * 2 − 1,007 * 2 = 869,538 Da
Jak widać, ustalenie dokładnej masy analizowanego związku nie jest oczywiste nawet z użyciem technik jonizacji nie prowadzących do fragmentacji. Znając warunki jonizacji oraz analizując całe widmo można jednak w pokazanym przykładzie odrzucić większość hipotez źródła sygnału 435,776. W warunkach jonizacji przez elektrorozpylanie, która była zastosowana do otrzymania omawianego widma, powstanie jonu posiadającego dwa ładunki elementarne jest najbardziej prawdopodobne na skutek oderwania jednego elektronu i przyłączenia jednego protonu. W widmie występuje też pik przy wartości 870,553 Th, który najprawdopodobniej pochodzi od cząsteczki o masie 870,553 Da. Przeciwko hipotezie, że pik przy wartości 435,776 Th pochodzi od jonu o podwójnym ładunku utworzonego z cząsteczki o masie 870,553 Da przemawia fakt zbyt niskiej intensywności piku 870,553 w stosunku do 435,776. Zwykle intensywność piku od jonu z jednym ładunkiem elementarnym w stosunku do odpowiedniego jonu z dwoma ładunkami, jest w technice elektrorozpylania jak 2:1 albo więcej. Ostatecznie więc można przyjąć z dużym prawdopodobieństwem, że pik 435,776 Th pochodzi najprawdopodobniej od jonu, który powstał ze związku o masie 435,776 Da.

Obwiednia izotopowa

Większość pierwiastków chemicznych występuje w przyrodzie w postaci kilku izotopów. Zwykle jeden izotop dominuje, pozostałe występują w mniejszej ilości. Różnice w masie cząsteczek powodowane przez występowanie izotopów są widoczne na widmach masowych, co oznacza, że sygnały od jednego związku chemicznego lub jego fragmentu występują na widmie w formie kilku pików.
o masie 859,5 Da zarejestrowana spektrometrem Q-TOF. Pierwszy pik to pik monoizotopowy. W piku tym występują tylko atomy dominujących izotopów. W cząsteczkach tworzących pik drugi występuje po jednym atomie izotopu cięższego o 1 Da od izotopu dominującego. W trzecim piku występują dwa takie atomy, a w czwartym – trzy.

Wymiana jednego atomu izotopu lżejszego na cięższy w cząsteczce zmienia jej masę o różnicę między masami tych izotopów. Gdy zatem występują cząsteczki, które różnią się tylko jednym izotopem, są one widoczne w widmie w postaci dwóch pików. Gdy uwzględnić dwa izotopy jednego atomu lub izotopy dwóch atomów, w związku chemicznym występować mogą już cząsteczki, o trzech różnych masach, co prowadzi do trzech sygnałów w widmie masowym. W przypadku dużych cząsteczek, takich jak białka możliwa jest obserwacja nawet kilkudziesięciu pików izotopowych. Charakterystyczny wzór pików (lub kształt jednego piku powstałego ze zlania sygnałów) pochodzących od różnych form związku chemicznego zawierającego atomy różnych izotopów nazywany jest obwiednią izotopową. Dla określenia charakterystycznego wzoru pików izotopowych używa się także terminu rozkład izotopowy.
Wiedząc jaka jest różnica pomiędzy masami podstawowych izotopów pierwiastków występujących w związku chemicznym można określić liczbę ładunków elementarnych poszczególnych jonów. Najczęściej, różnica masy pomiędzy kolejnymi izotopami jednego pierwiastka wynosi 1 Da, a zatem jeśli w widmie występują sygnały o różnicach 1 Th, sugeruje to, że analizowany jon posiadał pojedynczy ładunek elementarny. Jeśli różnica między bliskimi sobie pikami izotopowymi wynosi 0,5 Th to znaczy to, że cała seria sygnałów w ramach tej obwiedni pochodzi od jonów, które miały podwójny ładunek elementarny.
Ogólnie, w ramach jednej obwiedni ładunek jest w przybliżeniu równy wielokrotności masy neutronu (ok 1), kolejne piki są położone m/z kolejnych pików izotopowych. Gdy w jednym obszarze widma występują zarówno sygnały których różnica wynosi 1 i 0,5 Th, wskazuje to na fakt nałożenia na siebie dwóch lub więcej obwiedni izotopowych, pochodzących od dwóch lub więcej zestawów jonów, różniących się masą dwukrotnie. Takie sytuacje zdarzają się szczególnie często w analizach MALDI/TOF badających cząstki znacznie różniące się masą z niejednorodnych mieszanin polimerów.
Gdy warunki jonizacji pozwalają na tworzenie się jonów pochodzących od strukturalnie jednakowych fragmentów cząsteczki o dwóch różnych ładunkach, to wówczas w widmie widoczne są dwie lub więcej obwiednie izotopowe dla tych fragmentów, co bardzo komplikuje analizę widma. Z tego względu większość technik jonizacji stara się zapobiegać tego rodzaju sytuacji.
Większość związków organicznych, w których dominują atomy węgla, stosuje się do tej reguły i ułatwia rozpoznanie w widmie jonów wielokrotnie zjonizowanych. Wynika to z występowania węgla C12 i C13 różniących się masą o jeden Da. W przypadku gdy w związku występują znaczne ilości atomów pierwiastków posiadających izotopy różniące się masą o 2 i więcej daltonów (np.: chlor), wówczas analiza obwiedni izotopowych bardzo się komplikuje. Na podstawie charakterystycznej obwiedni izotopowej można często wnioskować o składzie pierwiastkowym badanego związku chemicznego. Tego typu analizy przeprowadza się zazwyczaj przy pomocy specjalistycznych programów komputerowych.
Spektrometria mas -

Rozdzielczość spektrometru mas

Rozdzielczość jest jednym z najważniejszych parametrów charakteryzujących spektrometr mas. Miarą rozdzielczości spektrometru jest zdolność do rozróżnienia dwóch jonów o pewnej różnicy stosunku masy do liczby ładunków elementarnych jonów (m/z). Spektrometr o rozdzielczości 1000 będzie umożliwiał rozróżnienie dwóch cząsteczek o m/z równym 1000 i 1001. Można przyjmować różne kryteria pomiaru rozdzielczości. Najczęściej uznaje się, że jeśli na widmie m/z dolina pomiędzy pikami dwóch jonów jest głębsza niż 50% wysokości pików, to są one rozróżnione.
Rozdzielczość nie jest zależna tylko od konstrukcji analizatora masy. Na rozdzielczość pomiaru wpływa wiele czynników. Często w ramach jednego widma obserwuje się piki od jonów zarejestrowanych z różną rozdzielczością.

Techniki jonizacji

Istnieje wiele metod jonizacji cząsteczek w spektrometrach mas. Do metod najczęściej używanych należą:
  • Jonizacja elektronami (Electron Ionisation – EI) – jonizacja przy pomocy wiązki elektronów. Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych cząsteczek. EI charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością – poniżej 1% cząsteczek ulega jonizacji.
Spektrometria mas -

  • Elektrorozpylanie (Electrospray, ESI), polegające na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną substancję z igły, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1–5 kV) pod ciśnieniem atmosferycznym. Jest to jedna z łagodnych metod jonizacji – zwykle nie powoduje fragmentacji badanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad wielkocząsteczkowymi biopolimerami takimi jak białka i oligonukleotydy.
  • Termorozpylanie (Termospray, TE) – jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną substancję wewnątrz stalowej kapilary. Gorąca substancja jest rozpylana w komorze próżniowej z prędkością naddźwiękową.
  • Jonizacja chemiczna (Chemical Ionisation, CI) – jony wytwarzane są na skutek zderzeń cząsteczek badanego związku chemicznego z jonami pierwotnymi obecnymi w źródle jonów. Jest to metoda nie powodująca fragmentacji cząsteczek (łagodna jonizacja). Jonizacja odbywa się zwykle przy ciśnieniu rzędu 60 Pa.
  • Bombardowanie szybkimi atomami (Fast-Atom Bombardment FAB), polegającą na bombardowaniu cząsteczki obojętnymi atomami o wysokiej energii (zwykle 17 lub 70 eV). Cząsteczki mogą znajdować się w fazie gazowej lub być rozpuszczone w ciekłej, mało lotnej substancji (matrycy) np. glicerolu.
  • Bombardowanie jonami (spektrometria mas jonów wtórnych – Secondary Ion Mass Spectrometry – SIMS) Metoda ta początkowo była stosowana do substancji przewodzących prąd lub substancji naniesionych na metalowe płytki. Obecnie metodę SIMS stosuje się z powodzeniem do substancji nie przewodzących prądu. Istnieje odmiana techniki SIMS, w której badana substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy (najczęściej glicerolu). Technika ta jest nazywana czasami LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) lub FIB (Fast Ion Bombardment).
  • Desorpcja laserowa (Laser Desorption – LD) – w której jonizacja następuje przez naświetlanie próbki silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami są wysokoenergetyczne fotony.
  • Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation – MALDI) – w której stosuje się jonizację laserową, ale z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich "wybijania" ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która jest później przekazywana do analizowanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad biopolimerami i polimerami syntetycznymi.
  • Plazma wzbudzona indukcyjnie (ICP) – jonizowana substancja jest wprowadzana do plazmy płomienia palnika znajdującego się w kwarcowej rurze. Rura otoczona jest cewką, przez którą przepływa prąd zmienny o wysokiej częstotliwości. Plazma ogrzewa się do temperatury rzędu 10 000 K w wyniku wzbudzenia polem magnetycznym wytworzonym przez prąd płynący w cewce. Metoda nadaje się doskonale do analizy pierwiastków metalicznych.
Wiele metod jonizacji cząsteczek takich jak FAB, EI i LD prowadzi do fragmentacji cząsteczek chemicznych w trakcie jonizacji, co powoduje, że różne spektrometry mogą generować różne widma dla tego samego związku chemicznego. Fragmentacja cząsteczek może pomagać w analizie, gdy badany jest jeden związek chemiczny. Pomiar masy takiego związku często nie wystarcza do jego identyfikacji, na którą pozwala analiza charakterystycznego wzoru fragmentacji takiego związku. W przypadku mieszanin wielu związków chemicznych, wtórne reakcje między jonami pochodzącymi z różnych związków, uniemożliwiają praktyczną analizę danych.
Typowym przykładem zastosowania spektrometrii mas do analizy mieszanin są badania proteomiczne, gdzie prawie zawsze występują złożone mieszaniny peptydów. Badania te są możliwe dzięki stosowaniu łagodnych metod jonizacji takich jak ESI i MALDI. Podczas stosowania łagodnych metod jonizacji tracona jest informacja o wzorze fragmentacji cząsteczek. Problem ten rozwiązuje zastosowanie tandemowych spektrometrów mas.

Analizatory masy

W spektrometrach mas stosowane są różne typy analizatorów masy:
  • Analizator czasu przelotu (Time Of Flight TOF) – jony wprowadzane do analizatora są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonego jonu w detektor. Pomiar m/z jest oparty na fakcie, że ze wzrostem masy cząsteczkowej jonów, wydłuża się ich czas przelotu. Obecnie stosuje się często analizatory czasu przelotu ze zwierciadłem elektrostatycznym, które zwiększa rozdzielczość aparatu, ale zmniejsza zakres dopuszczalnych mas cząsteczkowych. Analizatory TOF charakteryzują się stosunkowo dużymi rozdzielczościami rzędu kilkudziesięciu tysięcy (do 100 000) oraz dosyć dużą czułością. Są najczęściej stosowane razem ze źródłami jonów MALDI.
  • Sektor magnetyczny (Magnetic sector) analizator ten wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu magnetycznym. Tor lotu jonów jest zakrzywiany, stopień zakrzywienia lotu zależy od stosunku masy do ładunku (m/z) i prędkości jonu a także od parametrów pola magnetycznego. Sektor magnetyczny charakteryzuje się stosunkowo małą rozdzielczością – mniej niż 5000. Związane jest to głównie z dużymi różnicami prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem ten rozwiązuje przez zastosowanie sektora elektrycznego przed sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki są rozpędzane, dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze.
  • Sektor elektryczny urządzenie to wykorzystuje zjawisko zmiany toru lotu jonów w polu elektrostatycznym, jest zbudowane z dwóch równoległych, zakrzywionych płyt do których przyłożono potencjał elektryczny. Jony o jednakowej energii translacyjnej mają jednakowe tory lotu w sektorze elektrycznym. Za sektorem elektrycznym znajduje się szczelina przez którą przelatują tylko jony o określonej energii. Sektor elektryczny jest stosowany przed sektorami magnetycznymi w spektrometrach mas o podwójnym ogniskowaniu.
Spektrometria mas -
  • Kwadrupol (Quadrupole) Analizator ten jest zbudowany z czterech symetrycznie ułożonych równoległych prętów. Działa jako filtr masy – w jednym momencie przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z). Dzieje się to dzięki przykładaniu do prętów prądu zmiennego o określonej częstotliwości i napięciu oraz napięcia stałego. Kwadrupol można ustawić tak, aby przepuszczał jony o szerokim lub wąskim zakresie m/z. Jony przechodzące przez kwadrupol mogą być poddawane dalszej analizie.
  • Pułapka jonowa (Ion trap – IT) jest analizatorem pozwalającym na przetrzymywanie jonów. Analizator ten działa na zasadzie podobnej do kwadrupola. Manipulując parametrami prądu przyłączonego do elektrod można uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z) lub można uwięzić jony o szerokim zakresie m/z. Pomiaru masy dokonuje się przez uwięzienie w pułapce jonów o szerokim zakresie m/z i wyrzucanie z pułapki kolejnych grup jonów o określonym m/z. Wnętrze pułapki jonowej wypełnione jest gazem obojętnym – helem pod ciśnieniem rzędu 10-1 Pa. Jeżeli jony w pułapce zostaną wzbudzone (przyspieszone), zderzenia z atomami helu spowodują fragmentację jonów. Pułapki jonowe charakteryzują się zwykle dość niewielką rozdzielczością (kilku tysięcy) oraz bardzo dużą czułością.
  • Liniowa pułapka jonowa (Linear Ion Trap, Linear Trap Quadrupole – LTQ) jest zbudowana, jak kwadrupol, z czterech równoległych prętów. Na obu końcach analizatora przykładany jest potencjał elektryczny, który uniemożliwia ucieczkę jonów z analizatora. Pomiar masy odbywa się przez wyrzucanie jonów o określonym m/z z analizatrora i detekcję. W liniowych pułapkach jonowych stosuje się często dwa detektory, co zwiększa czułość. Liniowe pułapki jonowe charakteryzują się bardzo dużą czułością (większą niż zwykłe pułapki jonowe) i stosunkowo niską rozdzielczością (kilka tysięcy). W liniowej pułapce jonowej, jony można przechowywać, poddawać fragmentacji i mierzyć masy fragmentów.
  • Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (Ion Cyclotron Resonance ICR) Analizator cyklotronowy wykorzystuje zjawisko zakrzywienia toru lotu jonów w polu magnetycznym. Jony są pułapkowane w cyklotronie, gdzie wpadają w ruch kołowy. Widmo m/z jest tworzone przez działanie na jony polem elektromagnetycznym o zmieniającej się częstotliwości i rejestrację zmian natężenia prądu w płytach detektorowych lub zmiany absorpcji fali elektromagnetycznej. W analizatorze panuje bardzo wysoka próżnia – ciśnienie nie większe niż 10-4 Pa, zwykle 10-6 Pa lub mniejsze. Rozdzielczości analizatorów cyklotronowych mogą być bardzo duże, zwykle kilkaset tysięcy, mogą dochodzić nawet do miliona (przy m/z 500 Th). Rozdzielczości tych analizatorów szybko zmniejszają się wraz ze wzrostem m/z analizowanej cząsteczki.
  • Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-ICR) Analizator ten działa podobnie jak analizator cyklotronowego rezonansu jonowego. W analizatorze FT-ICR zastosowano bardziej wydajną metodę zbierania danych niż w ICR. W analizatorze FT-ICR przy pomocy złożonej fali elektromagnetycznej wzbudzane są jednocześnie wszystkie jony. Na płytach detektora rejestrowany jest sygnał zawierający wiele częstotliwości charakterystycznych dla jonów o różnym m/z. Sygnał ten jest przekształcany w widmo m/z przy pomocy Transformacji Fouriera. Analizatory FT-ICR są znacznie szybsze niż analizatory ICR, inne parametry (rozdzielczość, czułość itp.) są podobne. Analizatory FT-ICR wyparły obecnie z rynku analizatory ICR.
  • Orbitrap – zbudowany jest z dwóch elektrod zewnętrznych i jednej elektrody wewnętrznej pomiędzy którymi poruszają się jony. Tak więc analizator ten jest rodzajem pułapki jonowej. Elektrody zewnętrzne mają kształt zwężających się na jednym z końców beczek. Elektrody te są ustawione szerszymi końcami do siebie. Wrzecionowata elektroda wewnętrzna umieszczona jest w środku urządzenia, jej oś symetrii pokrywa się z osiami symetrii elektrod zewnętrznych. Jony wprowadzone do analizatora poruszają się dookoła oraz wzdłuż jego osi. Pomiar częstotliwości oscylacji jonów wzdłuż osi analizatora pozwala na obliczenie stosunku masy do ładunku jonu. Analizatory typu orbitrap charakteryzują się dużą rozdzielczością (do 200 000).

Detektory

Zadaniem detektora w spektrometrze mas jest rejestracja jonów, przechodzących przez analizator. Najprostszym i najstarszym detektorem jonów jest płyta fotograficzna. Obecnie płyty fotograficzne zostały zastąpione detektorami przekazującymi informację w postaci sygnałów elektrycznych. Sygnały te są we współczesnych spektrometrach mas przetwarzane na postać cyfrową i dalej analizowane i przechowywane z wykorzystaniem komputerów. Można wyróżnić kilka najczęściej stosowanych typów detektorów:
  • Puszka Faradaya – jest to metalowa, cylindryczna komora z otworem przez który wlatują jony. Jony wpadające do detektora trafiają na dno puszki i oddają swój ładunek. Powstający w ten sposób prąd jest mierzony. Detektory te charakteryzują się małą czułością.
  • Powielacz elektronowy – detektor zbudowany jest z serii płytek, do których przyłączono wysokie napięcie. Jony po uderzeniu w pierwszą płytkę (dynodę konwersyjną), powodują emisję elektronów. Elektrony te uderzają w kolejną płytkę (dynodę) powodując wybicie większej liczby elektronów. Z każdej, kolejnej płytki detektora wybijane jest coraz więcej elektronów – sygnał jest wzmacniany. Elektrony trafiają ostatecznie na anodę powodując przepływ prądu, który jest mierzony. W nowszych konstrukcjach powielaczy elektronowych serię dynod zastępuje się zakrzywioną zwężającą się rurą (powielacz elektronowy o dynodzie ciągłej). Elektrony uderzają wielokrotnie w ściany rury powodując emisję kolejnych elektronów. Dzięki kaskadowemu wzmocnieniu sygnału powielacze elektronowe są detektorami bardzo czułymi.
  • Detektor mikrokanalikowy – detektor zbudowany z płytki z niewielkimi (4-25 μm), zakrzywionymi otworami. Powierzchnia otworów pokryta jest półprzewodnikiem mającym zdolność emisji elektronów. Na stronie wejściowej płytki utrzymywany jest potencjał ujemny (napięcie rzędu 1 kV) w stosunku do strony wyjściowej. Jony wpadają do kanalików i zderzają się ze ścianami otworów powodując kaskadową emisję elektronów, podobnie jak w powielaczu elektronowym. Za każdym z kanalików znajduje się metalowa anoda zbierająca elektrony. Sygnał powstały w ten sposób jest mierzony.
  • Detektor fotopowielaczowy – składająca się z dwóch dynod konwersyjnych (jedna dla jonów dodatnich druga dla jonów ujemnych), ekranu fluorescencyjnego i fotopowielacza. Jony wpadające do detektora uderzają w dynodę konwersyjną powodując emisję elektronów. Elektrony są kierowane na ekran fluorescencyjny przy pomocy pola elektrycznego. Po uderzeniu elektronu w ekran emitowane są fotony, które trafiają do fotopowielacza. Fotopowielecz wzmacnia sygnał, który potem jest rejestrowany.
  • Detekcja w analizatorze cyklotronowego rezonansu jonów (ICR) – Analizatory ICR są jednocześnie detektorami jonów, nie wymagają one instalacji dodatkowych detektorów.

Klasyczna technika identyfikacji związków chemicznych

Spektrometria mas -

Klasyczna technika spektroskopii masowej polega na umieszczaniu w komorze jonizacyjnej czystych związków chemicznych, które następnie ulegają fragmentacji z użyciem techniki FAB lub EI. Widma czystych związków chemicznych otrzymywane techniką FAB lub EI przy określonej energii bombardujących cząstek prowadzą do zawsze takiego samego obrazu fragmentacji cząsteczki. Jednocześnie, niezwykle rzadko zdarza się, aby dwa różne związki chemiczne fragmentowały się w identyczny sposób. Widma masowe mogą być zatem z powodzeniem stosowane do identyfikacji związków chemicznych, aczkolwiek nie ze 100% pewnością. Dzięki temu, że określone grupy związków chemicznych ulegają fragmentacji w określony sposób, widma masowe umożliwiają też określenie prawdopodobnej struktury związków. Analizowanie widm masowych pod tym kątem jest jednak dość kłopotliwe i nie zawsze prowadzi do jednoznacznych konkluzji. Widma masowe są jednak stosowane jako komplementarna metoda w analizie, do NMR i spektroskopii IR przy ustalaniu struktur związków organicznych.

Połączenie spektrometrii mas z chromatografią

Spektrometria mas -

Spektrometria mas -
ESI – LTQ – FT-ICR. Własność IBB PAN
W analizach mających na celu identyfikację substancji zwykle ma się do czynienia z mieszaninami związków chemicznych. Identyfikacja wielu związków chemicznych znajdujących się w jednej próbce jest zwykle niemożliwa, jeśli stosuje się tylko spektrometr mas. Problem ten można rozwiązać łącząc spektrometrię mas z różnymi technikami rozdziału substancji, zwykle z chromatografią. Metodami najczęściej stosowanymi w połączeniu ze spektrometrią mas są chromatografia gazowa i wysokosprawna chromatografia cieczowa .
W układzie takim wszystkie substancje wychodzące z chromatografu kierowane są do źródła jonów w spektrometrze mas. Podczas analizy mieszanin, z chromatografu wydostają się kolejne, rozdzielone substancje. Spektrometr nie analizuje całej mieszaniny w jednym momencie, tylko kolejno poszczególne związki chemiczne. Oprócz informacji o masach i wzorze fragmentacji substancji podawanych przez spektrometr mas otrzymujemy informację o czasie retencji związków na kolumnie chromatografu.
Podczas analiz można mieć do czynienia z tak złożonymi mieszaninami, że w jednym momencie z chromatografu wychodzić będzie wiele związków chemicznych. W takich sytuacjach można użyć tandemowego spektrometru mas połączonego z chromatografem. W przypadku mniej złożonych mieszanin można zamiast chromatografii zastosować rozdział związków w pierwszym analizatorze tandemowego spektrometru mas.
Spektrometria mas bywa często łączona z elektroforezą kapilarną, która nie jest klasyfikowana jako metoda chromatograficzna. Elektroforeza kapilarna podobnie jak chromatografia cieczowa służy do rozdziału substancji w fazie ciekłej. Systemy, w których połączono spektrometr z elektroforezą kapilarną służą zwykle do analizy białek i kwasów nukleinowych.
Najczęściej stosowane konfiguracje systemów chromatograficznych ze spektrometrami mas:
  • Chromatografia gazowa i spektrometr mas (GC-MS)
Chromatograf rozdziela analizowaną próbkę na pojedyncze związki chemiczne, które są kolejno kierowane do spektrometru mas celem ich jednoznacznej identyfikacji. Technika ta określana skrótem GCMS jest powszechnie stosowana w przemyśle chemicznym i spożywczym, do analizy zanieczyszczeń środowiska, w badaniach biochemicznych, w badaniu próbek moczu i krwi sportowców w ramach testów antydopingowych.
  • Chromatografia cieczowa i spektrometr mas (LC-MS)
Wysokociśnieniowe chromatografy cieczowe (HPLC) są łączone ze spektrometrami mas. Najczęściej stosowanym w tym przypadku źródłem jonów jest elektrorozpylacz (ESI). W układach tych stosuje się często spektrometry tandemowe ze względu na dużą złożoność analizowanych próbek. Systemy takie są zwykle stosowane w badaniach proteomicznych do identyfikacji białek ze złożonych mieszanin, wykrywania zanieczyszczeń środowiska oraz w przemyśle spożywczym.

Spektrometry kwadrupolowe

Spektrometry te mogą być wyposażone w różne źródła jonów, najczęściej jest to: FAB, EI lub ESI. Analizatory kwadrupolowe charakteryzują się stosunkowo małą rozdzielczością (rzędu 2000) i czułością. Mimo to doskonale nadają się do wielu zastosowań. Spektrometry takie nie wymagają do pracy zbyt wysokiej próżni, a co za tym idzie dużych i kosztownych systemów pomp. Niewielkie rozmiary i umiarkowana cena przyczyniły się do ich popularności. Urządzenia takie są często stosowane w laboratoriach chemicznych, biochemicznych i analizy zanieczyszczeń środowiska. Spektrometry tego typu są powszechnie łączone z chromatografami gazowymi i cieczowymi. Obecnie produkowane są także przenośne urządzenia tego typu (mieszczące się w bagażniku samochodu). Urządzenia takie są często sprzężone z chromatografami gazowymi i mogą być stosowane do wykrywania broni chemicznej, zanieczyszczeń środowiska, narkotyków itp.

MALDI-TOF

Spektrometria mas -

Jedną z częściej stosowanych konfiguracji spektrometrów mas jest połączenie źródła jonów MALDI i analizatora TOF (MALDI-TOF). W instrumentach tego typu stosuje się analizatory TOF ze zwierciadłem jonowym lub bez zwierciadła. Instrumenty bez zwierciadła umożliwiają detekcję mas cząsteczkowych do kilkuset tysięcy daltonów.
Podstawową zaletą MALDI-TOF jest to, że technika ta umożliwia bezpośrednią detekcję składu populacji cząsteczek o dużych masach cząsteczkowych, takich jak mieszaniny białek czy polimerów syntetycznych. Spektrometry te znajdują także zastosowanie przy identyfikacji białek w proteomice. Są także coraz powszechniej stosowane do oznaczania średnich mas cząsteczkowych i polidyspersji polimerów.
Analizatory ze zwierciadłem jonowym charakteryzują się znacznie większą rozdzielczością, niestety nie nadają się do analizy bardzo dużych cząsteczek. Oba typy spektrometrów dzięki zastosowaniu źródła jonów typu MALDI pozwalają na bardzo szybkie analizy. Przeciętny spektrometr tego typu potrafi przeanalizować ponad 100 próbek w czasie godziny. Przygotowanie i podawanie próbek do spektrometru tego typu może łatwo zostać zautomatyzowane. Dzięki łatwości automatyzacji, niewielkim rozmiarom i umiarkowanej cenie, spektrometry takie nadają się do laboratoriów masowo przetwarzających próbki (np. laboratoria analityki medycznej).

Historia spektrometrii mas

Historia spektrometrii mas zaczęła się od badań Sir Josepha Johna Thomsona z Uniwersytetu w Cambridge dotyczących przewodzenia prądu przez gazy. Badania te doprowadziły do odkrycia elektronu w 1897 roku. Za te badania Thomson otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w 1906 roku.
Na początku XX wieku Thomson zaobserwował, że promieniowanie katodowe (wiązka elektronów) może zostać odchylone przez pole elektrostatyczne. Urządzenie, w którym zaobserwowano to zjawisko, jest prekursorem spektrometru mas. Thomson nie poprzestał na obserwacji odchylenia wiązki elektronów i zaczął badać odchylenia wiązek różnych jonów. Badania te doprowadziły do powstania w latach 1899-1911 pierwszego spektrometru mas, nazwanego przez Thomsona parabola spectrograph. W urządzeniu tym jony były poddawane działaniu pola elektromagnetycznego, co powodowało odchylenie toru ich lotu. Jony o różnym stosunku masy do ładunku (m/z) charakteryzowały się różnym stopniem odchylenia. Detektorem spektrometru Thomsona była płyta fotograficzna lub ekran fluorescencyjny. Jony o różnym m/z uderzały w różnych miejscach ekranu detektora.
Po I wojnie światowej współpracownik Thomsona, Francis William Aston zbudował spektrometr mas o znacznie większej rozdzielczości. Spektrometr ten pozwolił na obserwację izotopów. Za zbudowanie spektrometru mas i odkrycie wielu nie promieniotwórczych izotopów Astonowi przyznano Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 1922 roku. W tym samym czasie Arthur Jeffrey Dempster, podobnie jak Aston udoskonalił analizator magnetyczny. Dempster opracował także stosowaną do dziś metodę jonizacji substancji za pomocą strumienia elektronów (źródło jonów EI).
Thomson, Aston i Dempster stworzyli teoretyczne podstawy do rozwoju spektrometrii mas. Ponad sto lat od pierwszych doświadczeń Thomsona spektrometry mas są niezastąpionym narzędziem w pracy fizyków, chemików, biologów i lekarzy prowadzących badania naukowe na ziemi i w przestrzeni kosmicznej. Coraz częściej spektrometry mas są stosowane w przemyśle, wojsku, policji i innych instytucjach.
Biologia molekularna jest jedną z dziedzin intensywnie korzystających ze spektrometrii mas. Analiza wielkocząsteczkowych biopolimerów takich jak białka i kwasy nukleinowe nie byłaby możliwa bez wykorzystania łagodnych metod jonizacji – elektrorozpylania (ESI) i desorpcji laserowej z udziałem matrycy (MALDI). W roku 2002 Szwedzka Akademia Nauk przyznała Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii Johnowi Fennowi i Koichi Tanace za zastosowanie metod łagodnej jonizacji w badaniach wielkocząsteczkowych biopolimerów.

Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas

! Rok

Odkrycie Nazwiska badaczy
1899
- 1911
Zbudowanie pierwszego spektrometru mas Joseph John Thomson
1912
Widmo masowe tlen
u, azot
u, tlenek węgla|tlenku węgla
, dwutlenek węgla|dwutlenku węgla
, Fosgen|chlorku karbonylu
Joseph John Thomson
1913
Odkrycie izotopów Neon (pierwiastek)|neonu
: 20Ne i 22Ne
Joseph John Thomson
1918
Udoskonalenie sektor magnetyczny|sektora magnetycznego
i opracowanie źródła jonów Spektrometria mas#Techniki jonizacji|EI
Arthur Jeffrey Dempster
1919
Pomiar masy atomów Francis William Aston
1922
Pomiar Deficyt masy|defektu masy.
Francis William Aston
1930
Zastosowanie spektrometrii mas w chemia organiczna|chemii organicznej
R. Conrad
1932
Pokazanie równoważności masy i energii postulowanej przez Albert Einstein|Alberta Einsteina
K. T. Bainbridge
1934
Preparatywny rozdział jonów W. R. Smythe,L. H. Rumbaug, S. S. West
1942
Pierwszy sprzedany spektrometr mas Consolidated Energy Corporation
1946
Analizator czasu przelotu
(TOF)
William E. Stephens
1949
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów
(ICR)
J.A. Hipple, H. Sommer i H. A. Thomas
1953
Połączenie sektor magnetyczny|sektora magnetycznego
i sektor elektryczny|elektrycznego
– spektrometr o podwójnym ogniskowanie|ogniskowaniu
E. G. Johnson i A. O. Nier
1953
Kwadrupol (analizator masy)|Kwadrupolowy
analizator masy
W. Paul i H. Steinwedel
1958
Połączenie spektrometru mas z chromatografia gazowa|chromatografem gazowym
(GC)
1966
Sekwencjonowanie peptydy|peptydów
przy pomocy spektrometru mas
K. Biemann, C. Cone, B. R. Webster i B. P. Arsenault
1966
Spektrometria mas#Techniki jonizacji|Jonizacja Chemiczna
(CI)
B. Munson i F. H. Field
1968
Spektrometria mas#Techniki jonizacji|Jonizacja przez Elektrorozpylanie
(ESI)
Malcom Dole
1974
Jonizacja w plazma|plazmie
R. D. MacFarlane i D. F. Torgerson
1974
Analizator cyklotronowego rezonansu jonów z fourierowską transformacją wyników
Melvin B. Comisarow
i Alan G. Marshall
1978
Tandemowy spektrometr mas
z trzema kwadrupolami (Triple Quadropole MS)
Richard A. Yost
i Chris G. Enke
1980
Metoda jonizacji przez Spektrometria mas#Techniki jonizacji|termorozpylanie
M. L. Vestal
1981
Metoda jonizacji przez Spektrometria mas#Techniki jonizacji|bombardowanie szybkimi atomami
(FAB)
Michael Barber
1983
Opracowanie metody jonizacji przez Spektrometria mas#Techniki jonizacji|desorpcję laserem przy udziale matrycy – MALDI
( Nagroda Nobla
z Chemii w 2002 roku)
Kōichi Tanaka|Koichi Tanaka
, Michael Karas
i Franz Hillenkamp
1984
Pułapka jonowa
G. C. Statford, P. E. Kelly, J. E. P. Syka, W. E. Reynolds i J. F. J. Todd
1984
Wykorzystanie Spektrometria mas#Techniki jonizacji|elektrorozpylania
(ESI) do analizy Biopolimery|biopolimerów
(Nagroda Nobla w 2002 roku)
Gall Lydia
(ZSRR), John Fenn
(USA)

Bibliografia

  • Gary Siuzdak (1996) Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press (ISBN 0-12-647471-0).
  • E. de Hoffmann, J. Chatette, V. Stroobant (1994) Spectrométrie de masse; Masson Editeur, Paris; tłum. L. Konopski (1998) Spektrometria Mas; Wydawnictwa Naukowo-Techniczne (ISBN 83-204-2291-4).
  • Robert A. W. Johnstone, Malcolm E. Rosse (1996) Mass spectrometry for chemists and biochemists; Press Syndicate of the University of Cambridge; tłum. Karol Bal i Marek Daniewski; red. techn. Krystyna Jurkowska (2001) Spektrometria mas; Wydawnictwo Naukowe PWN SA (ISBN 83-01-13605-7).
  • Wstęp do Spektroskopii Mas, Bonne, Damien; Bonin, Hélène; Lamy, Adeline, Selaries, Orane; Tosin, Géraldine; Vhel, Romuald, Laboratoire de Synthèse et Méthodologie Organiques, CNRS (Kopia strony w archiwum).
Publikacja wraz ze zdjęciami jest udostępniona w Encyklopedii "Zgapedia" części portalu zgapa.pl. Treść objęta jest licencją GNU FDL Wolnej Dokumentacji w wersji 1.3 lub dowolnej pózniejszej opublikowanej przez Free Software Foundation i została ona opracowana na podstawie Wikipedii, tutaj możesz znaleźć artykuł źródłowy oraz autorów. Warunki użytkowania Encyklopedii znajdziesz na tej stronie.